ماتریس استخوانی دمینرالیزه (DBM) و حامل‌های ویسکوز: جایگزینی نوین برای پیوند استخوان

چالش بزرگ بازسازی استخوان

بازسازی نقایص استخوانی بزرگ، همواره یکی از دشوارترین چالش‌های پیش روی جراحان ارتوپد بوده است. این نقایص معمولاً در نتیجه ضربه‌های شدید، برداشتن تومورهای استخوانی، عفونت‌های عمیق یا شکستگی‌های جوش‌نخورده ایجاد می‌شوند. در چنین شرایطی، جراحان نیاز به موادی دارند که بتوانند جای خالی استخوان ازدست‌رفته را پر کرده و روند ترمیم طبیعی را تحریک کنند.

پیوند استخوان اتوگرافت؛ طلایی اما نه کامل

پیوند استخوان اتوگرافت (استخوان خود بیمار) که معمولاً از تاج خاصره برداشت می‌شود، به عنوان “استاندارد طلایی” درمان شناخته می‌شود. این روش سه ویژگی حیاتی را همزمان دارد: استئوکانداکتیویتی (هدایت رشد استخوان)، استئواینداکتیویتی (تحریک تشکیل استخوان) و استئوژنز (تولید استخوان جدید توسط سلول‌های زنده). با این حال، این روش عاری از اشکال نیست. برداشت استخوان از لگن بیمار نیاز به یک عمل جراحی جداگانه دارد که می‌تواند با عوارضی مانند درد مزمن، عفونت در محل برداشت، بی‌حسی موضعی و حتی شکستگی لگن همراه باشد. علاوه بر این، مقدار استخوان قابل برداشت محدود است و گاهی شکل استخوان برداشت‌شده با محل نقص هماهنگی ندارد. این محدودیت‌ها باعث شده که محققان و پزشکان به دنبال جایگزین‌های مناسب‌تری باشند.

ماتریس استخوانی دمینرالیزه (DBM) چیست؟

ماتریس استخوانی دمینرالیزه یا DBM، نوعی پیوند استخوانی آلوگرافت (از فرد دیگر) است که با استفاده از اسید، مواد معدنی استخوان حذف می‌شوند و در عوض، کلاژن (عمدتاً نوع یک)، پروتئین‌های غیرکلاژنی، فاکتورهای رشد استئواینداکتیو مانند BMP (پروتئین‌های مورفوژنتیک استخوان) و مقادیر کمی از مواد معدنی باقی‌مانده (بین ۱ تا ۶ درصد) حفظ می‌شوند. پس از این فرآیند، BMP که قبلاً در میان مواد معدنی محبوس بود، آزاد شده و می‌تواند پتانسیل کامل خود را برای تحریک تشکیل استخوان جدید اعمال کند. کلاژن باقی‌مانده نیز یک داربست سه‌بعدی فراهم می‌کند که سلول‌های بنیادی و رگ‌های خونی جدید می‌توانند به درون آن رشد کنند و استخوان‌سازی را تکمیل نمایند.

 مزایای استفاده از DBMچیست؟

استفاده از DBM برای بازسازی استخوان مزایای متعددی دارد: اولاً، محدودیتی در مقدار پیوند وجود ندارد و می‌توان از بانک‌های استخوانی مقادیر زیادی تهیه کرد. ثانیاً، نیاز به جراحی دوم برای برداشت استخوان از بدن بیمار را برطرف می‌کند و عوارض مربوط به محل برداشت را به صفر می‌رساند. ثالثاً، فرآیند دمینرالیزه کردن سلول‌های اصلی و باکتری‌های احتمالی موجود در استخوان اهدایی را از بین می‌برد که این امر خطر پس‌زدگی ایمنی و عفونت را کاهش می‌دهد. همچنین زمان جراحی و دوره نقاهت بیمار کوتاه‌تر می‌شود.

تاریخچه استفاده از DBM

استفاده از DBM به سال ۱۸۸۹ برمی‌گردد، زمانی که “سن” برای اولین بار از استخوان دمینرالیزه گاو برای ترمیم نقایص جمجمه و استخوان‌های بلند انسان استفاده کرد. اما نقطه عطف اصلی در سال ۱۹۶۵ رخ داد، زمانی که “اوریست” و همکارانش برای اولین بار از DBM مشتق‌شده از انسان برای ترمیم نقایص استخوانی و فیوژن ستون فقرات کمری استفاده کردند. از آن زمان تاکنون، DBM به طور فزاینده‌ای در جراحی‌های ارتوپدی به کار گرفته شده و تحقیقات گسترده‌ای در مورد توانایی‌های آن در بازسازی استخوان انجام گرفته است.

چالش استفاده از DBM به تنهایی چیست؟

اگرچه DBM به تنهایی نیز دارای پتانسیل استئواینداکتیو و استئوکانداکتیو است، اما استفاده از آن به شکل پودر یا ذرات آزاد با مشکلاتی همراه است. این ذرات ساختار سستی دارند و به راحتی در حین جراحی توسط خون‌شویی یا مایعات شستشو پراکنده می‌شوند. همچنین پر کردن نقایص با اشکال نامنظم با استفاده از مواد ازپیش‌ساخته شده ممکن است منجر به ایجاد فضای مرده شده و جوش‌نخوردگی یا تأخیر در بهبودی را به دنبال داشته باشد. به همین دلیل، امروزه محبوب‌ترین محصولات DBM به صورت بتونه یا خمیر قابل قالب‌گیری عرضه می‌شوند که می‌توانند به طور کامل و محکم محل نقص را پر کنند.

پودر استخوان؛ ذراتی برای بازسازی هدفمند استخوان

در بازسازی یک نقص استخوانی، تنها پر کردن فضای ایجادشده کافی نیست؛ ماده‌ای که در محل نقص قرار می‌گیرد باید بتواند شرایط مناسبی برای شکل‌گیری و رشد بافت استخوانی جدید فراهم کند. فرآورده‌های استخوانی به شکل پودر یا ذرات، یکی از گزینه‌هایی هستند که می‌توانند در چنین شرایطی مورد استفاده قرار گیرند.

در این فرآورده‌ها، استخوان فرآوری‌شده به ذراتی با اندازه و شکل مشخص تبدیل می‌شود. این ذرات پس از قرارگیری در محل موردنظر، سطح تماس مناسبی با بافت اطراف ایجاد می‌کنند و می‌توانند به‌عنوان بستری برای رشد تدریجی استخوان جدید عمل کنند. ویژگی‌های فیزیکی ذرات، از جمله اندازه، شکل و میزان تخلخل، می‌تواند بر نحوه قرارگیری آن‌ها در محل نقص و تعامل آن‌ها با بافت میزبان اثرگذار باشد.

یکی از نکات مهم در استفاده از پودرهای استخوانی، پایداری ماده در محل نقص است. ذرات آزاد ممکن است در حین جراحی یا پس از قرارگیری، تحت تأثیر خون و مایعات شست‌وشو جابه‌جا شوند. به همین دلیل، بسته به شرایط بالینی، گاهی لازم است ذرات به‌گونه‌ای در محل قرار گیرند که احتمال جابه‌جایی آن‌ها کاهش یابد. استفاده از مواد حامل زیست‌سازگار یکی از روش‌هایی است که می‌تواند به ایجاد انسجام بیشتر میان ذرات و حفظ ماده در محل موردنظر کمک کند.

در این میان، باید میان پودر استخوان معدنی و ماتریس استخوانی دمینرالیزه (DBM) تمایز قائل شد. در فرآورده‌های دمینرالیزه، بخش عمده‌ای از مواد معدنی استخوان طی فرآیند فرآوری حذف می‌شود و اجزای آلی ماتریکس استخوان حفظ می‌شوند. در مقابل، فرآورده‌های استخوانی معدنی، ویژگی‌های متفاوتی از نظر ترکیب و عملکرد زیستی دارند. بنابراین، انتخاب میان این فرآورده‌ها صرفاً به شکل ظاهری آن‌ها، مانند پودری یا ذره‌ای بودن، وابسته نیست و به ویژگی‌های ماده و هدف استفاده بستگی دارد.

از این منظر، پودر استخوان را می‌توان بخشی از مجموعه راهکارهای بازسازی استخوان دانست که در کنار فرآورده‌هایی مانند DBM، بسته به نوع و شرایط نقص استخوانی، می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد. شناخت تفاوت میان انواع فرآورده‌های استخوانی و ویژگی‌های هرکدام، به انتخاب مناسب‌تر ماده برای شرایط موردنظر کمک می‌کند.

حامل‌های ویسکوز؛ راه‌حلی برای چسبندگی و شکل‌پذیری

برای تبدیل پودر DBM به بتونه قابل استفاده، آن را با حامل‌های ویسکوز (چسبناک) زیست‌سازگار ترکیب می‌کنند. این حامل‌ها باید ویژگی‌های زیر را داشته باشند: زیست‌سازگاری کامل با بافت‌های بدن (غیرسمی، غیرایمن‌زا، غیرتراتوژن و غیرسرطان‌زا)، نرخ تخریب زیستی مناسب (هماهنگ با فرآیند استخوان‌سازی)، ویسکوزیته و شکل‌پذیری مطلوب، ریزساختار سه‌بعدی استئوکانداکتیو، و خواص مکانیکی بهینه. بر اساس وزن مولکولی، این حامل‌ها به دو دسته کلی پلیمری و با وزن مولکولی کم تقسیم می‌شوند.

حامل‌های پلیمری کیتوسان

کیتوسان که از کیتین (جزء اصلی اسکلت بیرونی سخت‌پوستان و حشرات) به دست می‌آید، یک پلی‌ساکارید خطی با خواص منحصربه‌فرد است. این ماده در محیط اسیدی حل شده و می‌تواند به صورت اسفنج‌های متخلخل درآید که برای کاشت استخوانی بسیار مناسب هستند. کیتوسان در بدن توسط آنزیم لیزوزیم تخریب شده و محصولات نهایی آن غیرسمی هستند. سرعت تخریب آن به درجه داستیل‌زدگی بستگی دارد؛ اشکال با داستیل‌زدگی بالا (بیش از ۸۵ درصد) تخریب کندتری دارند و ماه‌ها در بدن باقی می‌مانند. یکی از ویژگی‌های برجسته کیتوسان، بار مثبت کاتیونی آن است که باعث جذب پروتئوگلیکان‌های با بار منفی شده و چسبندگی استئوبلاست‌ها را تسهیل می‌کند. علاوه بر این، کیتوسان دارای خواص ضدباکتری، ضدقارچ، چسبندگی مخاطی، ضددرد و هموستاتیک است و به شکل‌های مختلفی مانند هیدروژل، پودر، میکروبیـد و نانوالیاف قابل تولید می‌باشد.

هیالورونیک اسید

هیالورونیک اسید یک مولکول خطی بزرگ با خواص ویسکوالاستیک منحصربه‌فرد است که به طور طبیعی در بافت‌های مختلف بدن مانند مفاصل، زجاجیه چشم، مایع سینوویال، غضروف و پوست وجود دارد. این ماده به دلیل داشتن گروه‌های کربوکسیل و هیدروکسیل فراوان، توانایی بالایی در حفظ آب دارد و می‌تواند بیش از ۴۰۰ برابر وزن خود آب جذب کند. هیالورونیک اسید نقش مهمی در ترمیم و بازسازی بافت‌ها ایفا می‌کند و تحقیقات نشان داده که هیدروژل‌های آن می‌توانند BMP را در خود نگه دارند و تعامل بین استئوکلاست‌ها و استئوبلاست‌ها را تحت تأثیر قرار دهند که این امر در بازسازی استخوان و بهبود شکستگی حیاتی است. بیشتر هیالورونیک اسید جذب‌شده در بدن، پس از ورود به غدد لنفاوی به مونوساکاریدها تجزیه شده و نهایتاً به دی‌اکسید کربن و آب تبدیل می‌شود که هیچ عارضه سمی برای بدن ندارد.

سدیم آلژینات

آلژینات فراوان‌ترین بیوپلیمر دریایی است که از جلبک‌های قهوه‌ای استخراج می‌شود. این ماده به گیاه انعطاف‌پذیری و استحکام لازم برای رشد در دریا را می‌دهد. آلژینات‌ها پلیمرهای خطی بدون انشعاب هستند که از دو واحد اسید گولورونیک و اسید مانورونیک تشکیل شده‌اند. تنها بخش‌های گولورونیکی قادر به تشکیل پیوندهای عرضی با کاتیون‌های دوظرفیتی مانند کلسیم هستند و ژل‌های نرمی ایجاد می‌کنند که اساس کاربردهای گوناگون این ماده است. سدیم آلژینات به آرامی در آب سرد حل شده و محلول کلوئیدی ویسکوز تشکیل می‌دهد. در مورد زیست‌سازگاری آلژینات‌ها، مطالعات نشان داده که به شرط خلوص بالا، این مواد سازگاری عالی با بافت‌های بدن دارند. ترکیب M/G (نسبت اسید مانورونیک به گولورونیک) و وزن مولکولی از عوامل مهم تأثیرگذار بر زیست‌سازگاری هستند.

کربوکسیمتیل‌سلولز

کربوکسیمتیل‌سلولز یا CMC، مشتقی از سلولز گیاهی است که به طور گسترده در صنعت داروسازی استفاده می‌شود. این ماده پودری سفید تا سفیدمایل به کرم، بی‌بو و کمی مرطوب‌کننده است و در آب در تمام دماها حل می‌شود اما در حلال‌های آلی عملاً نامحلول است. CMC یک عامل پایدارکننده، امولسیون‌کننده، غلیظ‌کننده و چسبنده است که می‌تواند آب را حفظ کرده و فیلم محافظ تشکیل دهد. یکی از مهم‌ترین کاربردهای CMC، خاصیت ضدچسبندگی آن است که عمدتاً از طریق جداسازی مکانیکی بافت‌ها عمل می‌کند. این ماده می‌تواند فعالیت یا تکثیر فیبروبلاست‌ها را تضعیف کند، از رسوب فیبرین روی سطوح سروزی آسیب‌دیده جلوگیری کند، و از حذف پلاسمینوژن از سطح زخم جلوگیری نماید. همچنین CMC دارای خاصیت هموستاتیک است و می‌تواند چسبندگی را با تنظیم فعال‌کننده پلاسمینوژن نوع اوروکیناز و گیرنده سلولی آن کاهش دهد.

کلاژن نوع یک

کلاژن نوع یک فراوان‌ترین پروتئین بدن پستانداران است و بیش از ۹۰ درصد جرم آلی استخوان را تشکیل می‌دهد. این ماده همچنین کلاژن اصلی تاندون‌ها، پوست، رباط‌ها و بسیاری از بافت‌های همبند است. ساختار کلاژن نوع یک به صورت یک مارپیچ سه‌گانه راست‌گرد است که از دو زنجیره آلفا-۱ و یک زنجیره آلفا-۲ تشکیل شده است. کلاژن نوع یک به دلیل ویژگی‌هایی مانند زیست‌تخریب‌پذیری، ایمنی‌زایی کم، القای بیان گیرنده BMP-۲ و امکان استخراج در مقیاس وسیع، برای کاربردهای پزشکی بسیار جذاب است. این ماده به گیراندازی، ذخیره‌سازی موضعی و تحویل فاکتورهای رشد و سیتوکین‌ها کمک می‌کند و نقش مهمی در توسعه اندام‌ها، بهبود زخم و ترمیم بافت دارد.

 پولوکسامر ۴۰۷

پولوکسامر ۴۰۷ یک کوپلیمر سه‌بلوکی است که از یک بلوک مرکزی آب‌گریز پلی‌اکسی‌پروپیلن و دو بلوک جانبی آب‌دوست پلی‌اکسی‌اتیلن تشکیل شده است. محلول آبی این ماده با غلظت ۲۰ تا ۳۰ درصد، خاصیت ژل‌شدگی حرارتی معکوس دارد؛ یعنی در دمای یخچال (۴-۵ درجه سانتی‌گراد) به صورت مایع است اما در دمای بدن به ژل تبدیل می‌شود. این ویژگی منحصربه‌فرد، پولوکسامر ۴۰۷ را به یک حامل ایده‌آل برای تزریق تبدیل کرده است، زیرا می‌توان آن را به صورت مایع سرد تزریق کرد و پس از ورود به بدن، در محل مورد نظر به ژل تبدیل شده و DBM را در خود نگه می‌دارد. با این حال، مصرف طولانی‌مدت پولوکسامر ۴۰۷ در موش‌ها تغییراتی در متابولیسم لیپیدها ایجاد کرده که این موضوع نیاز به تحقیقات بیشتر دارد.

حامل‌های با وزن مولکولی کم گلیسرول

گلیسرول یک ترکیب آلی شیرین، بی‌رنگ، شفاف و بی‌بو است که با آب، الکل، آمین‌ها و فنل‌ها به هر نسبتی مخلوط می‌شود. این ماده زیست‌سازگاری و ویسکوزیته خوبی دارد و یکی از رایج‌ترین حامل‌های ویسکوز برای DBM محسوب می‌شود. با این حال، گلیسرول در آب محلول بوده و ممکن است پایدار نباشد و در مصرف گسترده، پتانسیل سمی بودن دارد. البته در مطالعات بالینی و گزارش‌های منتشرشده درباره محصولات حاوی گلیسرول، هیچ عارضه جدی مرتبط با آن گزارش نشده است.

 سولفات کلسیم

سولفات کلسیم که معمولاً به عنوان گچ شناخته می‌شود، ماده‌ای معدنی با فرمول دی‌هیدرات سولفات کلسیم است. با حرارت‌دهی کنترل‌شده، آب خود را از دست داده و به سولفات کلسیم هم‌آبه (گچ پاریس) تبدیل می‌شود که خاصیت شکل‌پذیری و خودسخت‌شوندگی در محل دارد. این ویژگی، آن را برای پر کردن و ترمیم نقایص استخوانی بسیار مناسب می‌سازد. سولفات کلسیم دارای ساختاری مشابه استخوان است، استئوکانداکتیو بوده و ارزان‌قیمت می‌باشد. مکانیسم دقیق افزایش استخوان‌سازی توسط سولفات کلسیم هنوز به طور کامل شناخته نشده، اما تصور می‌شود که آزادسازی یون‌های کلسیم در محل، باعث تحریک تمایز استئوبلاست‌ها می‌شود. همچنین تغییر pH موضعی در حین حل شدن ماده، می‌تواند استخوان مجاور را دمینرالیزه کرده و فاکتورهای رشد متصل به ماتریکس را آزاد کند که این خود به تحریک استخوان‌سازی کمک می‌کند. زیست‌سازگاری سولفات کلسیم در مطالعات متعدد به اثبات رسیده و پاسخ التهابی حداقلی پس از کاشت آن مشاهده شده است.

 بیوگلاس فعال

بیوگلاس فعال در سال ۱۹۶۹ توسط “هنچ” ساخته شد و از سال ۱۹۸۵ به صورت بالینی مورد استفاده قرار گرفته است. این ماده دارای زیست‌سازگاری فوق‌العاده است و در مدل‌های حیوانی و انسانی هیچ پاسخ التهابی ایجاد نمی‌کند. بیوگلاس هم استئوکانداکتیو و هم استئواینداکتیو است و می‌تواند پیوند شیمیایی محکمی با استخوان برقرار کند. وقتی بیوگلاس در معرض مایعات بدن قرار می‌گیرد، سطح آن حل شده و یون‌های کلسیم، فسفر و سیلیسیم آزاد می‌شوند. این یون‌ها باعث تشکیل یک لایه ژل سیلیکا روی سطح شده و سپس کلسیم فسفات آمورف روی آن رسوب می‌کند. با گذشت زمان، این لایه به هیدروکسی‌کربنات‌آپاتیت تبدیل می‌شود که برای اتصال به استخوان ضروری است. جالب اینکه بیوگلاس می‌تواند ژن‌های مهمی مانند فاکتور رشد شبه‌انسولین و فاکتور رشد اندوتلیال عروقی را تنظیم کند که باعث تکثیر استئوبلاست‌ها و سبب افزایش رگ‌زایی می‌شود که برای تشکیل استخوان جدید حیاتی هستند.

 محصولات تجاری DBMتوسط چه شرکتی تولید می‌شود؟

امروزه محصولات تجاری متعددی با برندهای مختلف در بازار موجود هستند که هرکدام با حامل خاصی ترکیب شده‌اند:

فرآورده بافت ایرانیان با تمرکز بر توسعه و تولید محصولات آلوگرفت، در زمینه ارائه فرآورده‌های بافتی مورد استفاده در حوزه‌های مختلف پزشکی و دندان‌پزشکی فعالیت می‌کند. این شرکت با بهره‌گیری از دانش تخصصی، فناوری‌های نوین فرآوری بافت و استانداردهای کیفی، طیف متنوعی از محصولات آلوگرفت را با هدف حمایت از فرآیند ترمیم و بازسازی بافت در اختیار متخصصان حوزه سلامت قرار می‌دهد.

در سبد محصولات آلوگرفت فرآورده بافت ایرانیان، محصول DBM Putty تولید می‌شود. این محصول یک دمینرالایزد ماتریکس استخوان (Demineralized Bone Matrix) است که به‌صورت پوتی ارائه می‌شود و حاوی ذرات DBM با اندازه کمتر از ۵۰۰ میکرومتر به همراه هیالورونیک اسید است.

فرآورده بافت ایرانیان تولیدکننده محصولات آلوگرفت، از جمله DBM Putty، است. DBM Putty یک ماتریکس استخوانی دمینرالیزه‌شده است که با بهره‌گیری از ذرات DBM با اندازه کمتر از ۵۰۰ میکرومتر و هیالورونیک اسید، برای کاربردهای بازسازی و ترمیم استخوان طراحی شده است.

چشم‌انداز آینده

با وجود پیشرفت‌های چشمگیر در زمینه DBM و حامل‌های ویسکوز آن، هنوز محصول ایده‌آلی که تمام شرایط یک ماده پیوندی عالی را داشته باشد، وجود ندارد. همچنین، مواد مختلف، روش‌های متفاوت و حتی شرایط یکسان در پردازش محصولات DBM، فعالیت استئوژنیک متفاوتی ایجاد می‌کنند و هنوز شرایط بهینه برای حداکثر توانایی استخوان‌سازی به طور کامل شناخته نشده است. در آینده، ترکیب DBM با مواد دیگر مانند سلول‌های بنیادی مشتق از مغز استخوان، سلول‌های بذر (سلول‌های بنیادی مزانشیمی) و فاکتورهای رشد جدید، یکی از مهم‌ترین جهت‌گیری‌های تحقیقاتی خواهد بود. همچنین توسعه حامل‌های هوشمند با قابلیت رهایش کنترل‌شده فاکتورهای رشد، و استفاده از فناوری‌های نوین مانند چاپ سه‌بعدی برای ساخت داربست‌های شخصی‌سازی‌شده، افق‌های جدیدی را پیش روی پزشکی ترمیمی استخوان خواهد گشود.

 جمع‌بندی

ماتریس استخوانی دمینرالیزه همراه با حامل‌های ویسکوز مختلف، گزینه‌ای ایمن، مؤثر و در دسترس برای بازسازی استخوان محسوب می‌شود. این فناوری با کاهش عوارض مربوط به برداشت استخوان از بدن بیمار و ارائه قابلیت شکل‌پذیری مناسب، توانسته است جایگاه خود را در جراحی‌های ارتوپدی، به ویژه در فیوژن ستون فقرات، ترمیم شکستگی‌های پیچیده، درمان جوش‌نخوردگی و تومورهای خوش‌خیم استخوان تثبیت کند. با ادامه تحقیقات و توسعه محصولات جدید، انتظار می‌رود که DBM و مشتقات آن، نقش پررنگ‌تری در پزشکی ترمیمی ایفا کرده و آینده بازسازی استخوان را متحول سازند.

فرآورده‌های استخوانی فرآورده بافت ایرانیان

شرکت فرآورده بافت ایرانیان با تمرکز بر فرآوری و تولید محصولات آلوگرفت، مجموعه‌ای از فرآورده‌های بافتی مورد استفاده در بازسازی و ترمیم استخوان را ارائه می‌کند. این محصولات شامل انواع پودر و ذرات استخوانی، فرآورده‌های استخوانی و DBM Putty هستند که با توجه به ویژگی‌های هر فرآورده، برای کاربردهای مختلف بازسازی استخوان طراحی شده‌اند. برای آشنایی بیشتر با محصولات و ویژگی‌های هر یک از این فرآورده‌ها، می‌توانید به صفحه محصولات آلوگرفت استخوانی فرآورده بافت ایرانیان مراجعه کنید.

منبع مقاله

Zhang H, Yang L, Yang XG, Wang F, Feng JT, Hua KC, Li Q, Hu YC. Demineralized Bone Matrix Carriers and their Clinical Applications: An Overview. Orthopaedic Surgery. 2019;11(5):725–737. doi:10.1111/os.12509.